تاثیر خاموشی ژن E93 روی بیان ژن‌های دخیل در مسیر سیگنالینگ JH در تخمدان ماده های بالغ B. germanica
XML
نویسندگان
1گروه گیاهپزشکی ، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران
2عضو هیات علمی گروه گیاهپزشکی دانشکده علوم و مهندسی کشاورزی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران، ایران
3انستیتیو بیولوژی تکاملی، دانشگاه پومپئوفابرا، بارسلونا، اسپانیا
چکیده
سوسری آلمانی، Blattella germanica (L.) (Blattaria: Blattellidae)، یکی از مهمترین آفات بهداشتی و اقتصادی در ایران است. این گونه بعلت استفاده از محصولات کشاورزی در انبارها، مناطق مسکونی و تجاری و انتقال انواع بیماریها، باعث خسارت شدید اقتصادی می‌شود. اکثر تکنیک‌های کنترلی عمدتا بر اساس استفاده از حشره‌کش‌های شیمیایی است. بعلت هزینه های بالای اقتصادی و محیطی حشره‌کش‌ها و گسترش جمعیت‌های مقاوم به حشره‌کش‌ها، گسترش استراتژی‌های مدیریتی جدید آفت بر اساس IPM ضروری است. در سال‌های اخیر، تداخل در RNA (RNAi) پتانسیل زیادی در کنترل آفات حشره‌ای از طریق خاموشی ژن‌های حیاتی نشان داده است. RNAi یک فرایند سلولی است که در آن بیان ژن هدف به‌طور اختصاصی از طریق معرفی dsRNA باز داشته می‌شود. مسیر سیگنالینگ هورمون جوانی (JH) در متامورفوز و تولید مثل حشرات دخیل است. E93 (Ecdysteroid- dependent transcription factor Eip 93F) یک فاکتور رونویسی در پایین دست JH و ژن های Met و kr-h1 است و سیگنال آنتی متامورفیک JH را در حشرات انتقال می‌دهد. برای مشخص شدن نقش E93 در تولید مثل، E93 mRNA با استفاده از RNAi سیستمیک سرکوب شد. کلونی B. germanica بر روی غذای خشک سگ (Panlab 125C3) و آب درتاریکی در دمای 1±30 و رطوبت نسبی 70-60 درصد پرورش یافت. دز 2 میکروگرم dsE93 به شکم ماده‌های بالغ تازه ظاهر شده تزریق شد و مجددا تزریق در روز سوم تکرار شد. برای شاهد، ماده‌ها با دز مشابه با dsMock تیمار شدند. تشریح و آنالیزهای ترنسکریپتومی ژن‌های دخیل در سیگنالینگ JH در روز پنجم بالغین انجام شد. استخراج RNA کل از تخمدان و سنتز cDNA انجام شد. واکنش های Quantitative real time PCR (qRT-PCR) در سه تکرار با استفاده از SYBR Green انجام شد. میزان mRNA نسبت به بیان ژن BgActin-5c با استفاده از دستگاهiQ5 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories) تعیین شد. تمام داده‌ها با استفاده از آزمون T و نرم افزارهای Rest (2009) و اکسل آنالیز شدند. میزان E93 mRNA در تخمدان ماده‌های تحت تیمار dsE93 در روز پنجم تعیین شد. نتایج نشان داد که میزان بیان E93 در مقایسه با شاهد 36/38 درصد، به طور معنی دار، کمتر است (p˂0.05). بعلاوه سرکوبی بیان E93، روی بیان ژن های Met و Kr-h1 در تخمدان در مقایسه با شاهد تاثیر معنی داری نداشت. از نقطه نظر فنوتیپی، E93 RNAi به طور معنی داری محتوی کل پروتئین تخمدان، رشد اووسیت های پایه (7/9 درصد) و اندازه تخمدان ها را در مقایسه با شاهد کاهش داد. به نظر میرسد که E93 نقش کلیدی در اووژنسیس و نمو اووسیت های پایه از طریق مسیر سیگنالینگ دیگری که مستقل از مسیر سیگنالینگ JH است، بازی می کند. بنابراین E93 میتواند ژن کاندید مناسبی به عنوان جایگاه هدف بالقوه برای کنترل B. germanica در آینده با استفاده از تکنیکRNAi باشد.
کلیدواژه ها
موضوعات
 
Title
The effect of E93 gene silencing on the expression of genes that involve in JH signaling pathway in ovary of Blattella germanica adult female
Authors
Mahboubeh naghdi, Alireza Bandani, Xavier Belles
Abstract
The german cockroach, Blattella germanica (L.) (Blattaria: Blattellidae), is one of the most sanitary and economic important pests in Iran. This species causes severe economic damage because of using any agricultural productions in storages and residential areas and transmitting of a variety of diseases. Most control techniques mainly rely on using chemical insecticides. Because of the high economic and environmental costs of insecticides and evolution of insecticides resistant populations, there is an urgent need to develop new pest management strategies that based on IPM. In recent years, RNA interference (RNAi) has shown great potential in controlling insect pests by silencing vital genes. RNAi is a gene silencing mechanism in which the expression of a gene is specifically inhibited by its cognate double-stranded RNA. Juvenile hormone (JH) signaling pathway involves in insects’ metamorphosis and reproduction. E93 (Ecdysteroid- dependent transcription factor Eip 93F) is a transcriptional factor that placed in downstream of JH and Met and Kr-h1 genes and transmits the anti-metamorphic signaling of JH in insects. For clarifying the role of E93 in reproduction, E93 mRNA levels were knocked down by using systemic RNAi. The colony of B. germanica reared on dry dog food (Panlab 125C3) and water in the dark at 30 ± 1°C and 60-70% relative humidity. A dose of 2 µg of dsE93 was injected into the abdomen of freshly emerged adult females and injection was repeated on third day. For control, females equivalently treated with dsMock. The dissection and transcriptome analysis of genes that involve in JH signaling pathway, carried out on fifth day of adult stage. Total RNA extraction from ovary and cDNA synthesizing were carried out. Quantitative real time PCR (qRT-PCR) reactions were carried out in triplicate by using SYBR Green. Levels of mRNA were calculated relative to BgActin-5c expression by using the iQ5 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories). All data were analyzed by using of T test student and Rest (2009) and Excel. E93 mRNA levels were examined in the ovary of dsE93 treated females on day 5. The results showed that E93 expression was 38.39% lower in comparison with control significantly (p˂0.05). Beside, depletion of E93 expression didn’t affect the expression of Met and Kr-h1 in ovary in comparison with control significantly. In terms of phenotypic, E93 RNAi reduced significantly the total protein content of ovary, basal oocytes growth (9.7%), size of ovary compares with control. E93 appears to play key role in oogenesis and basal oocyte development by using another signaling pathway that independent on JH signaling. So, E93 can be an appropriate candidate gene as potential target site for controlling of B. germanica by using the RNAi technique in future.
Keywords
Blattella germanica, Juvenile hormone, RNAi