انتقال سازه بیانی pCaPR10 حامل پروموتر القائی ژن PR-10 نخود به سویه LBA4404 اگروباکتریوم و تایید مولکولی آن
XML
نویسندگان
1مشهد -آزادشهر- امامت 64 پلاک 78
2گروه گیاهپزشکی دانشکده کشاورزی دانشگاه فردوسی مشهد
3پژوهشکده علوم گیاهی دانشگاه فردوسی مشهد
چکیده
گیاه نخود با نام علمی Cicer aritinum L. جزء مهمترین حبوبات غذایی کشت شده در بسیاری از کشورهای تولید کننده و مصرف کننده نخود در جهان می باشد و سومین لگوم مهم جهان بعد از لوبیا و نخود فرنگی است که در سطح وسیع کشت می شود. متاسفانه عملکرد این محصول نسبت به سطح زیر کشت آن پایین است. مهمترین بیماری که باعث کاهش عملکرد این محصول می شود، بیماری برق زدگی است که به آن بلایت آسکوکیتایی نخود نیز گفته می شود که توسط قارچ Ascochyta rabiei با تلومورف Mycosphaerella rabiei ایجاد می شود. مهمترین راه کنترل این بیماری استفاده از ارقام مقاوم و PR پروتئین ها می باشد. پروتئین PR-10 در رشد و سازگاری گیاه با محیط زیست نقش داشته و ژن PR-10 در نخود قابل ردیابی است به طوری که توالی پروموتری این ژن مشابه دیگر PR پروتئین ها می تواند به سرعت در پاسخ به بیمارگر فعال گردد. جداسازی و آنالیز توالی پروموتر ژن های مرتبط با بیماری زایی می تواند در بیان هدفمند ژن های مقاومت بسیار کاربردی باشد. در این تحقیق به منظور آماده سازی سویه های اگروباکتریوم جهت آنالیز توالی پروموتر ژن PR-10 نخود، سازه بیانی حامل این پروموتر به نام pCaPR10 که در مطالعات اولیه آماده شده بود به همراه دو ناقل pCAMBIA3301 و pBI121 به عنوان شاهد به سویه LBA4404 با روش شوک حرارتی منتقل گردید. تایید کلنی های ترانسفورم شده با استفاده از روش کلنی PCR و به وسیله آغازگرهای PSh3-F/R و PKa-F/4R انجام شد. در الگوی الکتروفورزی محصولات واکنش، باندهای 1212، 1021 و 600 با اندازه های در حدود 1000 و 500 جفت باز مشاهده شدند که با اندازه قطعات مورد انتظار کاملا انطباق داشتند. سویه های تایید شده از نظر بررسی الگوی بیان پروکاریوتی ژن گزارشگر تحت کنترل پروموتر در کلنی های مختلف مورد بررسی قرار گرفتند و نتایج تنها بیان ژن گزارشگر GUS را در کلنی حامل ناقل pBI121 نشان داد و در کلنی های حاوی ناقل pCAMBIA3301 و سازه بیانی pCaPR10 هیچگونه بیانی مشاهده نشد. این نتایج تایید کننده عدم بیان پروکاریوتی ژن گزارشگر GUS واجد اینترون می باشد.
کلیدواژه ها
موضوعات
 
Title
Transformation of pCaPR10, the expression vector contains the inducible promoter of chickpea PR-10 gene, to Agrobacterium strain LBA4404 and its molecular confirmation
Authors
narges sadeghi, Mojtaba Mamarabadi, Farhad Shokouhifar
Abstract
Chickpea (Cicer aritinum L.) is one of the most important legumes in the world which has been produced and consumed in many countries since long. It is also the third widely cultivated legume in the world after bean and pea. Unfortunately, the yield of this crop is very low compared to the surface of the planted area. Ascochyta blight caused by the fungus Ascochyta rabiei (telomorph: Mycosphaerella rabiei) is the most important disease that reduces the yield of this crop. The current strategy to control this disease is the cultivation of resistant varieties containing PR proteins. The PR-10 protein plays a crucial role on the growth and adaptation of chickpea in environment. The PR-10 gene can be traced in this plant so that the promoter sequence of this gene can quickly be induced in response to the pathogens similar to the other PR proteins. Isolation and analysis of the promoter sequence belong to the pathogenesis-related genes can be very beneficial in the meaningful expression of resistance gene. In the present study, in order to prepare the Agrobacterium strains used in promoter analysis of chickpea PR-10 gene, the expression vector pCaPR10 carrying this promoter (which had already been constructed in the preliminary studies) along with the following vectors pCAMBIA3301 and pBI121 as control, were transferred to the LBA4404 strain using heat shock method. The transformed colonies were confirmed by colony PCR method using PSh3-F/R and PKa-F/4R primers. As expected, three bands related to the PCR products of 1212, 1021 and 600 with the size of 1000, 1000 and 500 were observed on agarose gel. The prokaryotic expression pattern of reporter gene under control of this promoter in confirmed strains was studied in different colonies. The results showed only the expression of GUS reporter gene in the colonies harboring pBI121 vector. No prokaryotic expression was observed in the colonies containing pCAMBIA3301 vector or pCaPR10 expression construct either. These results indicated the absence of prokaryotic expression in the intron-GUS reporter gene.
Keywords
Ascochyta rabiei, PR-10 protein, Ascochyta blight, chickpea