ردیابی ویروس موزاییک کرفس (CeMV) در گیاه گشنیز با استفاده از واکنش One-step RT-LAMP
XML
نویسندگان
1بزرگراه بسیج- میدان سردشت- صندوق پستی 3815688349
2گروه گیاهان داروئی و معطر، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه اراک، اراک، ایران ، کدپستی: 8349-8-38156.
3گروه بیماری شناسی گیاهی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران
4گروه گیاهپزشکی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه بیرجند، بیرجند، ایران.
چکیده
گشنیز (با نام علمی Coriandrum sativum L.) از خانواده چتریان، گیاهی دارویی و معطر با طول دوره رشدی یکساله است. در راستای اجرای طرح‌های اصلاح الگوی کشت و مدیریت منابع آبی، سطح زیر کشت این محصول در سال‌های اخیر توسعه یافته است. این بررسی به دنبال مشاهده علایم و با هدف شناسایی بیماری‌های ویروسی گشنیز در گلخانه‌های شهرستان اراک انجام شد. روش جدید RT-LAMP (loop-mediated isothermal amplification) در این پژوهش جهت تشخیص ویروس موزاییک کرفس (Celery Mosaic Virus, CeMV) به کار گرفته شد. در این روش از چهار آغازگر اختصاصی که شش ناحیه مشخص از توالی ژن هدف را شناسایی می‌کنند، استفاده می‌شود. آنزیم مورد استفاده، Bst DNA پلیمراز است که دارای خاصیت جایگزینی رشته و مقاوم به حرارت است. در بهار سال 1395، تعداد 44 نمونه گیاه گشنیز دارای علائم پیسک، موزائیک، زردی و پیچیدگی برگ انتهایی جمع‌آوری شد. طراحی آغازگرهای اختصاصی براساس چارچوب ژنی پروتئین پوششی ویروس مورد نظر و با استفاده از نرم افزار PrimerExplorer V5 صورت گرفت. استخراج RNA کل از نمونه‌ها با استفاده از کیت ستونی استخراج RNA (تهیه شده در شرکت دنازیست آسیا) بر اساس دستورالعمل شرکت تولید کننده کیت انجام شد. جهت انجام واکنش حجم نهایی 25 میکرولیتر حاوی 02/0 میلی مولار آر.ان.ای کل، 04/0 میلی مولار dNTP، 04/0 میلی‌مولار DDT، 02/0 میلی‌مولار RNasin، 06/0 میلی‌مولار آغازگر FIP، 06/0 میلی‌مولار آغازگر BIP، 04/0 میلی مولار آغازگر LB، 04/0 میلی مولار آغازگر LF، 02/0 میلی‌مولار آغازگر F3، 02/0 میلی‌مولار آغازگر B3، 08/0 میلی‌مولار بتایین، 04/0 میلی‌مولار MgSO4، 1/0 میلی‌مولار بافر Bst(10X) و 1/0 میلی‌مولار آب عاری از RNase، 2/0 میلی‌مولار آنزیم M-Mulv RT و 04/0 میلی‌مولار آنزیم Bst DNA پلیمراز تهیه شد و واکنش در دمای 63 درجه سانتی‌گراد به مدت یک ساعت و در آخر 2 دقیقه در دمای 80 درجه سانتی‌گراد در حمام آب گرم انجام شد. پس از انجام آزمایش، تیوب‌ها از دستگاه خارج شد و کدورت حاصل از واکنش مثبت در 8 نمونه مشاهده شد. همچنین 5 میکرولیتر از محصول در ژل آگارز 1%، الکتروفورز و پس از رنگ‌آمیزی با اتیدیوم بروماید با دستگاه ژل داک عکس‌برداری شد. از طرف دیگر، مایه‌زنی گیاهان محک Chenopodium amaranticolor و C. quinoa با عصاره نمونه‌های جمع‌آوری شده، سبب بروز علایمی چون موزاییک خفیف و لکه‌های موضعی کلروز گردید. تشخیص سریع، حساسیت بالا، سهولت در انجام کار و کاهش هزینه‌ها از جمله مزایای کدورت ناشی از رسوب پیروفسفات منیزیم در روش RT-LAMP می‌باشد.
کلیدواژه ها
موضوعات
 
Title
Detection of Celery Mosaic Virus (CeMV) in Coriander by One-step RT-LAMP
Authors
Faezehossadat Abtahi, Mehrnaz Hatami, Seyedeh Lavin Nourani, Seyede Atefeh Hosseini
Abstract
Coriander (Coriandrum sativum L.) belongs to Apiaceae family, is an annual, medicinal and aromatic plant. Area under coriander cultivation has increased over recent years, due to planning and implementing appropriate crop patterns. This study was aimed to the identification of coriander viral diseases in Arak greenhouses. A reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) assay is a novel method, which has been used to diagnose Celery Mosaic Virus (CeMV) in this study. A RT-LAMP assay amplified DNA with four oligonucleotide primers which recognize six distinct regions on the target DNA in conjunction with two loop primers to accelerate the reaction and a heat-resistant DNA polymerase with strand displacement activity .During spring of 2016, a total number of 44 coriander plants with symptoms including mottle, mosaic, yellowing and leaf curly top were collected. LAMP specific primers corresponding to the conserved coat protein gene were designed using Primer ExplorerV5 software (specific for LAMP) respectively. Total RNA was extracted using RNA column extraction kit (Denazist Asia, Iran). The reaction was performed in a 25 µl mixture containing a final concentration of 0.02 mM RNA, 0.04 mM dNTP, 0.04 mM DDT, 0.02 mM RNasin, 0.06 mM of primer FIP, 0.06 mM of primer BIP, 0.04 mM of primer LB, 0.04 mM of primer LF, 0.02 mM of primer F3, 0.02 mM of primer B3, 0.08 mM Betaine, 0.04 mM MgSO4, 0.1 mM Bst (10x) buffer, 0.1 mM RNase-free water, 0.2 mM of M-Mulv RT and 0.04 mM Bst DNA polymerase. Reaction mixtures were incubated at 63◦C for 1 h and terminated in an 80◦C water bath for 2 min. Visual inspection of the LAMP amplification products was observed in 8 tubes by turbidity due to the formation of precipitate of magnesium pyrophosphate. Five microliters of product were electrophoresed on a 1% agarose gel stained with ethidium bromide. On the other hand, Chenopodium amaranticolor and C. quinoa which were inoculated with the extract of the collected samples, showed mottle and chlorotic local lesion. Some advantages of turbidity of magnesium pyrophosphate in RT-LAMP method are rapid detection, high sensitivity, ease of work and cost-effective.
Keywords
RT-LAMP, Turbidity, Celery Mosaic Virus (CeMV)