فعالیت تجزیه کننده dsRNA در میدگات سن گندم
XML
نویسندگان
1زاهدان- خیابان دانشگاه. کوی اساتید
2عضو هیات علمی گروه گیاهپزشکی دانشکده علوم و مهندسی کشاورزی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی دانشگاه تهران، ایران
چکیده
سن گندم Eurygaster integriceps Puton (Hemiptera: Scutelleridae) آفت کلیدی گندم است که خسارت شدید کمی و کیفی به گندم وارد میکند. مکانیسم خاموشی ژن پس از رونویسی، تداخل در RNA (RNAi)، پتانسیل این را دارد که در استراتژی حفاظت از محصول علیه حشرات مهم آفت با هدف قرار دادن mRNA توسط RNA دو رشته ای (dsRNA) به کار رود. وجود نوکلئازها در میدگات حشره که منجر به تجزیه dsRNA میشود، میتواند با موفقیت تکنیک RNAi و یا غلظت dsRNA استفاده شده در این تکنیک مرتبط باشد. هدف مطالعه حاضر اندازه گیری فعالیت تجزیه کننده dsRNA در میدگات سن گندم است. بدین منظور، dsRNA با استفاده از T7 RNA پلیمراز ساخته شد. پرایمرهای مخصوص توالی با استفاده از پروموتر T7 در قسمت انتهای 5ˈ برای ساخت فرگمنت cDNA حاوی منطقه پروموتر T7 در انتهای 5ˈ هر دو رشته سنس و آنتی سنس طراحی شد. dsDNA تکثیر شده به عنوان الگویی برای ساخت dsRNA با استفاده از کیت MEGAscript® RNAi kit (Ambion, Life Technologies) به کار برده شد. میدگات پوره های سن 5 تشریح و در 100 میکرولیتر آب دو بار تقطیر هموژنایز شد. سپس نمونه به مدت 3 دقیقه در 3000 rpm سانتریفیوژ شد و سوپرناتانت حاصل به عنوان شیره معده جدا شد. ده و 150 نانوگرم dsRNA به 10 میکرولیتر شیره میدگات که به طور سریالی رقیق شده بود (یعنی 100، 50، 20، 10 و 2% از عصاره اصلی)، اضافه شد. به عنوان شاهد، 10 و 150 نانوگرم از dsRNA به 10 میکرولیتر آب دوبار تقطیر اضافه شد. همچنین به عنوان شاهد دوم، 10 میکرولیتر شیره معده بدون اضافه کردن dsRNA در نظر گرفته شد. پس از 5 دقیقه زمان انکوباسیون، نمونه ها با استفاده از الکتروفورز آگارز 1% بررسی شد. با انکوبه کردن 10 نانوگرم از dsRNA در 100% و 50% شیره معده، شیره معده سن گندم dsRNA را تجزیه کرده و باند آن در ژل آگارز ناپدید شد. داده های آزمایش نشان دهنده حضور فعالیت تجزیه کننده dsRNA در شیره معده سن گندم بود.
کلیدواژه ها
موضوعات
 
Title
Sunn pest Midgut dsRNA degrading activity
Authors
Azam Amiri, Alireza Bandani
Abstract
Sunn pest Eurygaster integriceps Puton (Hemiptera: Scutelleridae) is a serious pest of cereals which causes severe quantitative and qualitative damage to crops. The post-transcriptional gene silencing mechanism, RNA interference (RNAi), has a potential to be used in crop protection strategy against important insect pests by targeting mRNA via double-stranded RNA (dsRNA). The presence of nucleases in the insect midget that results in the decomposition of dsRNA can be linked to the RNAi technique success or to the concentration of dsRNA used in this technique. The aim of the current study is to evaluate the Sunn pest midgut dsRNA degrading activity. To do this, dsRNA was synthesized by using T7 RNA polymerase. Sequence-specific primers were designed with a T7 promoter at the 5ˈend to synthesize cDNA fragments which contained the T7 promoter region in the 5ˈend of both sense and antisense strands. The amplified dsDNA was used as template for dsRNA synthesis with the MEGAscript® RNAi kit (Ambion, Life Technologies). Fifth instar larvae midgut was dissected and homogenized in 100 µl of 2-distilled water then the sample was centrifuged for 3 min at 3000 rpm and the resulting supernatants were separated as midgut juice. Ten and 150 ng of dsRNA was added to 10 µl midgut juice which was serially diluted (i.e. 100, 50, 20, 10, and 2% of original extract). As a control, 10 and 150 ng of dsRNA was added to 10 µl 2-distilled water. As well as a second control consisting of 10 µl of midgut juice, without adding dsRNA was considered. After 5 minutes incubation time, the samples were analysed using 1% agarose electrophoresis. By incubating 10 ng of dsRNA in 100% and 50% midgut juice, Sunn pest midgut juice degraded dsRNA and its band disappeared in the agarose gel. The experimental data showed the presence of a dsRNA degrading activity in the midgut juice of the Sunn pest.
Keywords
Eurygaster integriceps