تعیین فیلوتیپ و سکووار جدایه های باکتری Ralstonia solanacearum، عامل بیماری پژمردگی باکتریایی سیب زمینی در جنوب استان کرمان
XML
نویسندگان
1بهشهر-روستای شهیدآباد خیابان هوتو کمربند کوچه شهید علی اکبر بیاتی
2بخش گیاهپزشکی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان
3مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی جنوب استان کرمان
476169-14111
چکیده
جنوب استان کرمان (منطقه جیرفت ) یکی از مناطق مهم تولید سیب زمینی در ایران است وپژمردگی باکتریایی یکی از بیماریهای مهم این محصول در این منطقه است. گونه مرکب Ralstonia solanacearum از نظر فیلوژنتیکی به چهار فیلوتیپ و 57 سکووار تقسیم می شود. در اردیبهشت ماه 1396، مزارع سیب زمینی منطقه جیرفت بازدید شد و از غده های بوته های آلوده با علایم شاخص پژمردگی باکتریایی، نمونه برداری انجام شد. سپس باکتری عامل بیماری از غده ها بر روی محیط کشت کلمن حاوی تری فنیل تترازولیوم کلراید جدا سازی و21 جدایه خالص سازی گردید. جهت تایید جدایه ها، از آزمون واکنش های زنجیره ای پلیمراز و با استفاده از جفت آغازگر اختصاصی(760/759) گونه یاد شده استفاده شد. سپس با استفاده از مصرف برخی از دی ساکاریدها و قندهای الکلی، بیوارجدایه ها تعیین گردید. همچنین جهت تعیین فیلوتیپ جدایه ها، از پی سی آر چندگانه ویژه فیلوتیپ ها (Pmx-PCR) با آغازگرهای مبتنی بر ترادف نوکلئوتیدی فاصله بین دو ژن 16S-23S ( چهار آغازگر پیشرو اختصاصی، هریک ویژه هر فیلوتیپ و یک آغازگر پسرو) استفاده گردید. جهت تعیین سکووار جدایه ها ، با استفاده از جفت آغازگر Endo-F و Endo-R، قطعه "دی ان آ " با اندازه 750 جفت باز از ژن اندوگلوکاناز 11 جدایه تکثیر و تعیین ترادف شد. بعد از انجام بلاست (BLAST) در بانک جهانی ژن، با انتخاب برخی جدایه های خویشاوند، به کمک نرم افزار مگا نسخه 6 وبا روش آماری نزدیکترین همسایه، درخت فیلوژنتیک جدایه ها ترسیم گردید. نتایج آزمون های بیوشیمایی نشان داد که تمام جدایه ها متعلق به بیوار 2 گونه R. solanacearum هستند. همچنین در آزمون Pmx-PCR دو قطعه "دی ان آ" با اندازه های 372 جفت باز( ویژه فیلوتیپ) و 281 جفت باز ( قطعه عمومی فیلوتیپ ها) از "دی ان آ" ژنومی جدایه ها تکثیر گردید. نتایج تجزیه و تحلیل شجره شناسی ترادف نوکلئوتیدی ژن اندوگلوکاناز جدایه ها و نیز Pmx-PCR نشان داد که همه آنها به فیلوتیپ II-B و سکووار یک باکتری R. solanacearum تعلق دارند. هویت فیلوتیپی و سکوواری جدایه ها با نرم افزار R. solanacearum Typing Program نیز تایید گردید. این اولین گزارش از جایگاه فیلوتیپی و سکوواری عامل بیماری پژمردگی باکتریایی سیب زمینی در استان کرمان است.
کلیدواژه ها
موضوعات
 
Title
Phylotype and sequevar determination of Ralstonia solanacearum, the causal agent of bacterial wilt of potato in southern Kerman province
Authors
ali mollaee, Akbar Hosseinipour, Mehdi Azadvar, Hossain Massumi
Abstract
The southern Kerman province (Jiroft) is one of the main regions for potato production in Iran. Bacterial wilt is a serious disease of potato in this region. The pathogen, Ralstonia solanacearum species complex, is divided to 4 phylotypes and 57 sequevars. In May 2017, potato fields of the Jiroft region were surveyed. Tuber samples were collected from the diseased potato plants showing typical bacterial wilt symptoms. Pure bacterial cultures were isolated from the tubers on Kelman's triphenyltetrazolium chloride agar medium and a total of 21 isolates were obtained. The R. solanacearum species complex-specific primer pair 759/760 was used to confirm the identity of all the isolates. The biovar of the isolates was determined on the basis of the utilization of disaccharides and hexose alcohols. Furthermore, the phylotype assignment of the isolates was carried out by a Pmx-PCR (phylotype multiplex PCR) with primers targeting the internal transcribed spacer region (four forward primers each specific for one phylotype and one reverse primer). To determine sequevar of the isolates, a 750-bp DNA fragment from endoglucanase (egl) gene was amplified from the genomic DNA of each isolate by the primer pair Endo-F and Endo-R. PCR products were sequenced and a phylogenetic tree was constructed by MEGA 6.0 software using the neighbor-joining method. Results of biochemical tests indicated that all isolates belong to the biovar 2. Moreover, in Pmx-PCR test, two DNA fragments with the size of 372 (the phylotype specific amplicon) and 281bp (R. solanacearum-specific 281 bp amplicon) were amplified from the isolates genomic DNA. The phylogenetic analysis of the egl gene sequences of the R. solanacearum isolates and comparison of the obtained sequences with those available in Genbank and Pmx-PCR revealed that all of the tested isolates belong to phylotype IIB and sequevar 1. The sequevar and phylotype identification of the isolates were also confirmed by R. solanacearum typing program software. This is the first study to report the determination of phylotype and sequevar of R. solanacearum isolates infecting potato in Kerman province.
Keywords
Pmx-PCR, Bacterial wilt, Endoglucanase gene, Jiroft region