همسانه‌سازی و بیان ژن پروتئین پوششی جدایه ایرانی ویروس لکه حلقوی نکروتیک هسته‌دارها (Prunus necrotic ring spot virus) در باکتری Escherichia coli
نویسندگان
1بخش تحقیقات ویروس شناسی گیاهی، موسسه تحقیقات گیاهپزشکی کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، تهران
2بخش تحقیقات ویروس‌های گیاهی، موسسه تحقیقات گیاهپزشکی کشور، سازمان تحقیقات، آموزش و ترویج کشاورزی، تهران
چکیده
ویروس لکه حلقوی نکروتیک هسته‌دارها (Prunus necrotic ringspot virus-PNRSV) متعلق به Illarvirus از خانواده Bromoviridae، یکی از چندین ویروس آلوده کننده درختان هسته‌دار می‌باشد. این ویروس دارای گسترش وسیعی بوده و موجب خسارت جدی در درختان هسته‌دار می‌گردد. علائم ایجاد شده توسط این ویروس شامل لکه‌های حلقوی سبزرد، موزائیک، بدشکلی برگ‌ها، تاخیر در رسیدن میوه‌ها، کاهش رشد و کاهش تولید میوه می‌باشد. همچنین این ویروس ممکن است بدون بروز علائم و به صورت نهان در درختان آلوده وجود داشته باشد. مشخص شده است که در نتیجه آلودگی با PNRSV توان رشد درختان تا 30 درصد و میزان محصول بین 20 تا 56 درصد کاهش یافته و کیقیت میوه‌ها نیز تحت تاثیر قرار می‌گیرد. استفاده از روش سرلوژیکی الایزا که نسبتا ارزان می‌باشد، هنوز هم یکی از بهترین انتخاب‌ها برای بررسی آلودگی تعداد زیاد نمونه‌ها می‌باشد. از آزمون الایزا برای صدور گواهی سلامت برای درختان استفاده می‌شود که اولین قدم برای محافظت درختان در برابر عوامل ویروسی می‌باشد. از فن‌آوری دی.ان.ای نوترکیب برای بیان ژن پروتئین پوششی در سلول‌های باکتریایی استفاده شده و پروتئین پوششی نوترکیب (rCP) به عنوان ایمنوژن برای تولید آنتی‌بادی به کار برده می‌شود. در این بررسی ژن پروتئین پوششی یک جدایه ایرانی PNRSV تکثیر و توالی آن تعیین گردید. توالی ژن پروتئین پوششی جدایه مورد نظر با استفاده از آغازگرهای اختصاصی دارای محل‌های برش در دو سمت 3’ و 5’ در ناقل بیانی pET28a(+) همسانه سازی گردید. پروتئین پوششی نوترکیب به دست آمده به باکتری E. coli BL21 انتقال یافت. سلول‌های مستعد باکتری با استفاده از SDS-PAGE و Western Blot مورد بررسی قرار گرفتند. نتایج به دست آمده بیان پروتئین پوششی به وزن تقریبی 27 کیلودالتون را نشان داد که ماهیت این پروتئین با آنتی‌سرم مرجع اختصاصی PNRSV مورد تایید قرار گرفت. این اولین گزارش از همسانه‌سازی و بیان پروتئین نوترکیب PNRSV برای یک جدایه ایرانی می‌باشد.
کلیدواژه ها
موضوعات
Title
Cloning and expression of coat protein gene of an Iranian Prunus necrotic ring spot virus isolate in Escherichia coli
Authors
Shirin Farzadfar, Reza Pourrahim
Abstract
Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV) (Bromoviridae family, Illarvirus genus) is among a large number of viruses which infect many stone fruit trees. PNRSV has a worldwide distribution and causing important losses. This virus induces different symptoms including necrotic and chlorotic ring spots, mosaic, leaf deformation, delayed maturation, reduce growth and reducing productivity, although, the virus may be present latently without symptoms or obvious damage. It was indicated that PNRSV reduced vigor up to 30%, yield reduction 20 to 56%, and decrease fruit quality. Enzyme linked immnuosorbent assay (ELISA) is considered as one of the best choices for conducting large number of infection assays as it is relatively cheap. ELISA was used for certification, which demonstrates the first step of protection against fruit tree viruses. Recombinant DNA technology has been used for expression of virus coat protein (CP) gene in prokaryotic bacterial cells and the recombinant CP (rCP) is used as immunogen in antibody production. In this study, CP gene of an Iranian PNRSV isolate has been amplified using RT-PCR, cloned and their nucleotide sequence have been determined. A predominant PNRSV isolate was selected and its CP gene was amplified using specific primers designed in this study and cloned into pET28a(+) expression vector. Expression of rCP in transformed E. coli BL21 competent cells was tested using SDS-PAGE and Western Blot assays. A protein product with the expected weight about 27 kDa was detected which showed positive reaction with the reference PNRSV specific antibody. This is a first repot of cloning and transcription of rCP of Iranian PNRSV isolate.
Keywords
Prunus necrotic ringspot virus, recombinant coat protein