ردیابی ویروس تریستزای مرکبات در شته جالیز با استفاده ازRT-PCR آشیانه‌ای
کد مقاله : 2008-23IPPC
نویسندگان
1'گیلان-رودسر
2پژوهشکده مرکبات و میوه های نیمه گرمسیری - رامسر
3گروه گیاه‌پزشکی دانشکده کشاورزی دانشگاه گیلان، رشت
4رامسر- بلوار شهید رزاقی - پژوهشکده مرکبات و میوه های نیمه گرمسیری
چکیده
ویروس تریستزای مرکبات closterovirus (CTV) Citrus tristeza، عامل مهم‌ترین بیماری ویروسی مرکبات است و شته جالیز (Aphis gossypii) به عنوان ناقل کارای این ویروس در تعدادی از کشورها از جمله در ایران معرفی شده است. تاکنون ردیابی ویروس تریستزا در ناقل براساس روش‌های کاربرد گیاه محک، سرولوژی و میکروسکوپ الکترونی صورت گرفته و این تحقیق، اولین مورد از کاربرد تکنیک‌های مولکولی در این زمینه در ایران است. در RT-PCR آشیانه‌ای (RT-nested-PCR)، فراورده حاصل از RT-PCR به عنوان الگو در واکنش دیگر PCR مورد استفاده قرار می‌گیرد. به این منظور، جدایه SD4 از کلکسیون ویروسی پژوهشکده مرکبات و میوه‌های نیمه‌گرمسیری جهت آزمون انتقال ویروس انتخاب گردید. این جدایه از باغات با علایم زوال پرتقال روی پایه نارنج در خارج از کانون اصلی آلودگی شهرستان ساری به دست آمد و کارایی روش‌های بیولوژی، سرولوژی و مولکولی در تشخیص آن پیش‌تر مورد بررسی قرار گرفت. سه ماه پس از انتقال ویروس با کلنی خالص شده شته جالیز روی خیار (Cucumis sativus)، حضور ویروس در گیاهان گیرنده مکزیکن لایم (aurantifoli Citrus) بر اساس علایم و با استفاده از RT-PCR با کمک جفت آغازگرهای اختصاصی T36CPF/T36CPR از بافت گیاهان مورد تایید قرار گرفت. در تشخیص مستقیم ویروس از شته، RT-PCR یک مرحله‌ای و RNA استخراج شده از شته‌ها به روش ترایزول به کار رفت و باندهای خفیفی به اندازه 672 جفت باز به دست آمد. با انجام مرحله دوم PCR، براساس فرآورده به دست آمده از مرحله اول با کمک جفت آغازگرهای T36CPF/P25R، قطعات مشخص با اندازه 362 جفت باز حاصل گردید. RT-nested-PCR بر اساس ترکیب آغازگرهای PinF/PinR PexF/PexR-، به دلیل ظهور مثبت کاذب و روش در شرایط مطالعه حاضر قادر به ردیابی ویروس در شته‌های آلوده نبودند. بر اساس نتایج این تحقیق، RT-PCR آشیانه‌ای، روشی کاربردی در مطالعات بررسی اپیدمی‌شناسی ویروس است و در صورت انتخاب آغازگرهای مناسب، قادر است مقادیر جزئی ویروس را در شته‌های ناقل تشخیص دهد.
کلیدواژه ها
موضوعات
Title
Detection of Citrus tristeza virus in Aphis gossypii by RT-nested-PCR
Authors
fereshteh esmaeilzadeh, Seyyed Mehdi Bani Hashemiyan, Ahmad Rouhibakhsh, Sirous Aghajanzadeh
Abstract
Citrus tristeza closterovirus (CTV) is the causal agent of the most important viral disease of citrus. Aphis gossypii is known as the vector of CTV in a number of countries, including in Iran. Detection of the virus in its vector has been carried out using indicator plant, serology and electron microscopy in the country. This is the first application of molecular techniques in this field in Iran. In RT-nested-PCR, the final product of RT-PCR is used as a template for other PCR reaction. SD4 isolate originated from declining sweet orange trees on sour orange of an infected orchard of Sari, Mazandaran province was used. The efficacy of biological, serological and molecular methods in detection of the SD4 was investigated in the earlier studies. The virus was transmitted by a purified aphid colony of A. gossypii from cucumber (Cucumis sativus) to Mexican lime (citrus aurantifolia) recipient plants. After three months, the presence of the virus in the plants was confirmed by RT-PCR with specific T36CPF/T36CPR primers. In direct detection of CTV from aphids, RNA extraction by Trizol method and a RT-PCR with T36CPF/T36CPR primers were used and a mild band of 672 bp was obtained. The final product of this reaction was used in nested-PCR reaction using T36CPF/P25R primers and specific products of 362 bp were obtained. RT-nested-PCR with PinF/PinR-PexF/PexR primers was not able to detect the virus in the infected aphids due to presence of false positives. Based on the results of the study, RT-nested-PCR using appropriate primers is an useful method in the epidemiological studies of the virus, and can detect the small amounts of the virus in the vector aphids.
Keywords
aphid, Citrus, Tristeza, virus