بررسی امکان مهار زیستی بیماری لکه‌برگی باکتریایی گوجه‌فرنگی در آزمایشگاه و گلخانه

کد مقاله : 1782-23IPPC
نویسندگان
1ارومیه- کیلومتر 11 جاده سرو- پردیش دانشگاه ارومیه-دانشکده کشاورزی- گروه گیاه پزشکی
2گروه گیاه‌پزشکی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه ارومیه
چکیده
بیماری لکه‌برگی گوجه‌فرنگی که توسط باکتری Pseudomonas syringae pv. syringae ایجاد می‌شود، از بیماری‌های مهم اقتصادی در مزارع و گلخانه‌های تولید گوجه‌فرنگی می‌باشد. در این مطالعه، امکان مهار زیستی این بیماری توسط سویه‌هایی از باکتری‌های مفید Pseudomonas fluorescens و Bacillus subtilis در آزمایشگاه و گلخانه مورد بررسی قرار گرفت. سویه‌های باکتری بیمارگر و مفید در تابستان سال 1395 از مزارع گوجه‌فرنگی آذربایجان‌غربی جداسازی شدند. شناسایی این سویه‌ها با استفاده از آزمون‌های مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی انجام شد. جهت شناسایی مولکولی باکتری‌های مفید از آغازگرهای عمومی fD1/rP2 مربوط به ژن 16S rRNA در واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز انجام شد. پس از تکثیر قطعه 1500 جفت‌بازی و تعیین توالی آن‌ها، مقایسه توالی‌های مورد بررسی با توالی‌های ثبت شده در بانک اطلاعاتی GenBank انجام شد. شناسایی ژنتیکی سویه‌های باکتری بیمارگر با استفاده از آغازگرهای عمومی 16S rRNA و آغازگرهای اختصاصی Tom1/Tom2 انجام شد. سویه بیمارگر مورد بررسی، قطعه 242 جفت بازی را تکثیر نمود. جهت غربالگری اولیه، مقدار 100 میکرولیتر سوسپانسیون CFUml-1 107×1 باکتری بیماری‌زا روی محیط نوترینت آگار (NA) پخش شد. میزان توان مهار زیستی باکتری‌های آنتاگونیست با استفاده از روش نشت متابولیت‌های ثانویه در آگار ارزیابی شد. برای این منظور، چاهک‌هایی به فاصله 2 سانتی‌متر روی محیط تلقیح شده ایجاد شد و درون آن‌ها 100 میکرولیتر سوسپانسیون CFUml-1 109×1 باکتری‌های مفید ریخته شد. پس از دو روز قطر هاله بازدارنده از رشد اندازه‌گیری شد. بر اساس نتایج این آزمون، قطر هاله بازدارنده ایجاد شده توسط سویه‌های مختلف باکتری مفید بین صفر و 15 میلی‌متر متغیر بود. تعداد چهار سویه باکتری P. fluorescens و هشت سویه باکتری B. subtilis جهت بررسی‌های گلخانه‌ای انتخاب شدند. باکتری‌های مفید با استفاده از متیل سلولز 1% به بذر گوجه‌فرنگی رقم استاندارد Early urbana Y متصل شدند. آلوده‌سازی بوته‌های گوجه‌فرنگی در مرحله 5-4 برگی با خراش دادن سطح برگ با استفاده از پودر کاربوراندوم و اسپری سوسپانسیون CFUml-1 105×1 باکتری بیماری‌زا روی اندام هوایی انجام شد. پس از 21 روز، تاثیر باکتری‌های آنتاگونیست در کاهش بیماری نسبت به تیمار شاهد مورد ارزیابی قرار گرفت. میزان لکه‌های ایجاد شده نسبت به کل سطح برگ به عنوان شاخص بیماری در نظر گرفته شد. بر اساس نتایج حاصل از این آزمایش به ترتیب سویه‌های باکتریایی Bs5، Bs27 و Pf7 بیشترین تاثیر را در کاهش لکه‌های کلروزه سطح برگ نشان دادند. این سویه‌ها به ترتیب 65، 40 و 27 درصد بیماری را نسبت به شاهد آلوده کاهش دادند. سویه‌های Pf95-1 و Bs32-M با 5 درصد کاهش بیماری، کم‌ترین تاثیر را در مهار بیماری نشان دادند. مطالعات تکمیلی روی باکتری‌های برتر این مطالعه در حال انجام است.
کلیدواژه ها
موضوعات
 
Title
Investigating the possibility of biological control of tomato bacterial leaf spot in laboratory and greenhouse
Authors
Farzaneh Mohammad Sour, Afsaneh Abbaspour Anbi, Maryam Khezri
Abstract
Tomato leaf spot incited by Pseudomonas syringae pv. syringae is a major economic disease in tomato fields and greenhouses. In this study, possibility of disease biological control was investigated by some strains of beneficial bacteria including Pseudomonas fluorescens and Bacillus subtilis, in vitro and in vivo. In summer 2016, pathogenic and benefit bacteria were isolated from tomato in West Azarbaijan fields. Identification of studied strains was performed using morphological, biochemical and physiological experiments. Molecular identification of beneficial bacteria was performed using universal primers of 16S rRNA gene (fD1/rP2). After amplifying 1500-bp fragment and sequencing, the sequences compared with those sequences in GenBank. Genetic identification of pathogenic strains carried out using universal primers of 16S rRNA and specific primers of Tom1/Tom2. The studied strain amplified 242 bp fragment. To primary screening, 100 µL of pathogenic bacteria suspension (1×107 CFUml-1) was spread on nutrient agar (NA) medium. Biological control capability of antagonistic bacteria was evaluated via secondary metabolites diffusion in agar procedure. For this, wells were created at a distance of 2 centimeters on the inoculated medium and 100 μl of beneficial bacteria suspension (1×107 CFUml-1) was poured in them. After two days, the diameter of the inhibitory zone was measured. The results indicated that diameter of inhibition zone was between 0 and 15 millimeters. Four P. fluorescens strains and eight B. subtilis strains were selected for greenhouse studies. Beneficial bacteria were attached to tomato seeds cv. Early urbana Y using 1% methyl cellulose. Inoculation of tomato seedling was done at the 4-5 leaf stage. Carborundum powder used for scratching the leaf surfaces, and then pathogenic bacteria suspension of 1×105 CFUml-1 sprayed on seedling foliage. After 21 days, the effect of antagonistic bacteria on disease reduction was evaluated compared to control. The surface area of spots related to the total leaf area was considered as a disease index. Based on the results, strains of Bs5, Bs27 and Pf7 showed the most effects on decreasing the leaf chlorotic spot created by pathogenic bacteria. These strains reduced 65, 40 and 27 percentage of the disease compared to the infected control, respectively. Pf95-1 and Bs32-M with a 5% disease reduction showed the least biocontrol effects. Additional studies on these strains are going.
Keywords
Disease management, Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis, Pseudomonas syringae pv. syringae