ردیابی و اثبات بیماری‌زایی ویروس پیچیدگی برگ یونجه (ALCV) در مزارع یونجه ایران
کد مقاله : 1745-23IPPC
نویسندگان
زهره داودی 1 ، جهانگیر حیدرنژاد2 ، حسین معصومی3 ، سیسیل ریکه4 ، سرگ گلزی5 ، دنی فیلو4 ، فیلیپ رومگناک6
1کرمان-بزرگراه امام خمینی-میدان پژوهش-دانشگاه شهید باهنر
2-بخش گیاهپزشکی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شهید باهنر کرمان
376169-14111
4موسسه تحقیقات و توسعه کشاورزی، سیراد، مونت‌پولیه، فرانسه
52- موسسه تحقیقات و توسعه کشاورزی، سیراد، مونت‌پولیه، فرانسه
6- موسسه تحقیقات و توسعه کشاورزی، سیراد، مونت‌پولیه، فرانسه
چکیده
اعضای خانواده Geminiviridae بیماریهای مهمی بر روی گیاهان در سرتاسر جهان ایجاد می کنند. جمینی‌ویروس‌ها بر اساس سازمان ژنوم، حشره ناقل و دامنه میزبانی به نه جنس تقسیم می‌شوند. ویروس پیچیدگی برگ یونجه (Alfalfa leaf curl virus, ALCV) یکی از گونه‌های جنس جدید Capulavirus می‌باشد که برای اولین بار از روی یونجه با علایم پیچیدگی برگ در فرانسه و اسپانیا و اخیرا از آرژانتین گزارش شده است. این ویروس با شته Aphis craccivora انتقال می‌یابد و اولین گزارش از جمینی‌ویروس‌های انتقال یافته با شته می‌باشد. مطالعات قبلی وجود این ویروس را در استان‌های اصفهان، کرمان و ارومیه اثبات نمود. برای مطالعات بیشتر در طی سال‌های 94 تا 96 نمونه‌هایی از گیاهان مزارع آلوده یونجه استان‌های مختلف شامل چهارمحال و بختیاری، خوزستان، خراسان رضوی، فارس، سیستان و بلوچستان، هرمزگان و لرستان و مجددا از اصفهان و کرمان با علائم پیچیدگی و تاخوردن برگ‌ها جمع آوری شد. آلودگی نمونه‌ها پس از استخراج دی‌اِن‌اِ با روش CTAB با استفاده از آزمون PCR اثبات گردید. سپس ژنوم کامل هر جدایه با استفاده از یک جفت آغازگر اختصاصی همپوشان (Cap-ncoIF و Cap-ncoIR) تکثیر شد. باند مربوطه به طول تقریبی سه کیلو باز از ژل استخراج شد و در ناقل pGEM®-T Easy همسانه‌سازی گردید. در نهایت، ژنومِ کامل جدایه‌‌ها به روش سنگر تعیین ترادف شده و ترادف‌های حاصل با کمک نرم‌افزارهای مربوطه با جدایههای موجود در بانک ژن مقایسه شدند. بر اساس نتایج به‌دست آمده، میزان تشابه جدایههای ایرانی ALCV به‌دست آمده از گیاه یونجه استان‌های مورد مطالعه با یکدیگر و با جدایههای دیگر گزارش شده از فرانسه، اسپانیا و آرژانتین موجود در بانک جهانی ژن بین 9/81 تا 3/95 درصد تعیین گردید. به‌منظور اثبات بیماری‌زائی و تعیین میزبان‌های آزمایشگاهی جدایه ایرانی ALCV، همسانه عفونت‌زای یکی از جدایههای این ویروس (ME8) به روش واحدهای دوتایی ناقص (partial dimer)، در ناقل دوگانه pGreen 0029 ساخته شد. سازه نوترکیب به سلول‌های باکتری Agrobacterium tumefaciens C58 منتقل شد و آزمون بیماری‌زایی بر روی چندین میزبان آزمایشگاهی انجام شد. دی‌اِن‌اِ برگ‌های جدید مربوط به گیاهان مایه کوبی شده استخراج گردید. آزمون PCR و تعیین ترادف محصولات به‌دست آمده نشان داد که سازه ساخته شده قادر به ایجاد آلودگی بر روی یونجه، باقلا، شلغم، لوبیا و توتون می‌باشد. ردیابی ALCV در برگ‌های جدید مایه‌زنی شده بیانگر عفونت‌زایی سازه ساخته شده می‌باشد. بر اساس نتایج این تحقیق، این اولین گزارش از شیوع ALCV در مزارع یونجه استان‌های مختلف ایران می‌باشد. مطالعات بیشتر جهت تعیین میزبان‌های دیگر این ویروس در طبیعت در حال انجام می‌باشد.
کلیدواژه ها
موضوعات
Title
Detection and demonstration of infectivity of Alfalfa leaf curl virus (ALCV) in alfalfa growing farms in Iran
Authors
Zohreh Davoodi, Jahangir Heydarnejad, Hossain Massumi, Cecile Richet, Serge Galzi, Denis Filloux, Philippe Roumagnac
Abstract
Members of the family Geminiviridae cause important diseases in many plants worldwide. Based on the genome organization, insect vector and host range, geminiviruses are classified into nine genera. Alfalfa leaf curl virus (ALCV) is a member of the newly established genus Capulavirus which was first reported from alfalfa with leaf curl symptom in France, Spain and recently Argentina. ALCV is transmitted by the Aphis craccivora and it is the first geminivirus transmitted by the aphid. Previous study confirmed the ALCV infection of alfalfa in Isfahan, Kerman and Urmia provinces. More samples showing leaf curl and folding symptoms were collected from Chaharmahal and Bakhtiari, Khuzestan, Razavi Khorasan, Fars, Sistan and Bluchestan, Hormozgan, Lorestan, Isfahan and Kerman. DNA of the samples was extracted and the ALCV infection of the samples confirmed by PCR. The full-length genome of isolates was amplified in PCR using back to back primers Cap-ncoIF and Cap-ncoIR. Approximate 3 kb in length segment was recovered from the agarose gel and cloned into the pGEM®-T Easy vector followed by Sanger sequencing. Nucleotide sequence of ALCV isolates was compared with together and GenBank isolates from France, Spain and Argentina. Results showed that Iranian ALCV isolates shared 81.9-95.3% identities with each other and GenBank isolates. In order to demonstrate infectivity of Iranian ALCV isolate and determine experimental host range, partial dimer of the full-length genome was constructed for the ME8 isolate and cloned into pGreen 0029 binary vector. Recombinant plasmid was transferred into Agrobacterium tumefaciens C58 cells and used for agroinoculation of test plants. The ALCV agroinfection of alfalfa, faba bean, turnip and tobacco was confirmed by PCR and sequencing. According to the results of this study, this is the first report of the ALCV incidence in alfalfa growing farms in Iran. More studies are in progress to identify other natural hosts of ALCV.
Keywords
: alfalfa, capulavirus, infectious clone