همراهی فیتوپلاسمایی از گروه افژولش شبدر (16SrVI) با بیماری جارویی شدن فلفل از استان خراسان رضوی
کد مقاله : 1658-23IPPC
نویسندگان
استان خراسان رضوی، مشهد، روبروی پلیس راه طرق، مرکز تحقیقات و آموزش کشاورزی و منابع طبیعی خراسان رضوی، بخش گیاهپزشکی
چکیده
فلفل با نام علمی (Capsicum annuum)یکی از محصولات مهم زراعی در جهان است که با توجه به اهمیت غذایی و مصرف قابل توجه آن اخیراً کشت فلفل در کشور، بالاخص در گلخانه‌ها توسعه یافته است. لذا شناسایی عوامل بیماریزا و محدود کننده کشت این گیاهان، بسیار حائز اهمیت است. طی بازدید‌های به عمل آمده در سال 1396، از مزارع استان خراسان رضوی (شهرستان سبزوار)، علایمی نظیر جارویی شدن بوته، ضخیم شدن و فنجانی شدن برگها و زردی بین رگبرگها در برخی از بوته‌های فلفل مشاهده شد. از این نمونه‌ها دی. ان. ای کل استخراج گردید و جهت بررسی آلودگی فیتوپلاسمایی آنها، از روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) و جفت آغازگرهای عمومی P1/P7 (دور اول) و آغازگرهای آشیانه‌ای R16F2n/R16R2 (دور دوم) استفاده شد. محصول PCR با آغازگر P1/P7 با استفاده از InsT/Aclone TM PCR Product Cloning Kit در پلاسمید pTZ57R/Tو در سویه Escherichia coli DH5α همسانه سازی و سپس قطعه همسانه سازی شده به صورت دو طرفه خوانش و تعیین ترادف گردید. آنالیز فیلوژنی قطعه توالی یابی شده به همراه دیگر توالی‌های فیتوپلاسمایی مشابه موجود در بانک ژن انجام شد و در نهایت چند شکلی طولی قطعات حاصل از هضم (RFLP) مجازی محصول PCR آشیانه‌ای، انجام گرفت. در تمام نمونه‌های دارای علایم به ترتیب برای جفت آغازگرهایP1/P7 وR16F2n/R16R2 ، قطعاتی به طول تقریبی 1800 و 1250 جفت باز تکثیر شدند. تحت همین شرایط هیچ قطعه‌ای در نمونه‌های دی. ان. ای حاصل از گیاهان بدون علایم و آب مقطر سترون به عنوان کنترل منفی تکثیر نشد. جست و جو با برنامه بلاست، با استفاده از قطعه توالی یابی شده، نشان داد که جارویی شدن فلفل بیشترین شباهت را به میزان 99 درصد با فیتوپلاسمای افژولش شبدر (Clover proliferation group,16SrVI) دارد. آنالیز فیلوژنتیکی با استفاده از نرم افزار MEGA7 نشان داد که فیتوپلاسمای عامل جاروک فلفل با فیتوپلاسماهای گروه 16SrVI طبقه بندی می‌شود. با استفاده از برنامه مجازی iPhyClassifier ، RFLP مجازی قطعه تکثیر شده با جفت آغازگر (R16F2n/R16R2) انجام شد و در نتیجه تعلق فیتوپلاسمای عامل جاروک فلفل را به زیر گروه A گروه 16SrVI (با ضریب تشابه 1) تایید نمود.
کلیدواژه ها
موضوعات
Title
The Association of Clover Proliferation Phytoplasma group (16SrVI) with witches’-broom disease of Pepper in Razavi Khorasan province of Iran
Authors
Sara Gharouni Kardani
Abstract
Pepper (Capsicum annuum L.) is an economically important crop in tropical and subtropical countries all over the world. Therefore, it is very important to identify pathogenic factors and limit the cultivation of these plants. During a survey in 2017, pepper plants with witches’-broom symptoms (PWB) were observed in production fields in some regions of Razavi Khorasan province of Iran (Sabzevar city). In addition, affected plants showed interveinal yellowing, cupped leaves, and proliferation symptoms. Leaf samples were collected from symptomatic and asymptomatic plants. Total DNA was extracted from leaf midribs of each plant sample and used as template in a polymerase chain reaction (PCR) assay with phytoplasma universal primer pair P1/P7 in first step and 16F2n/16R2 in second step. Expected length DNA fragments of nearly 1,800 and 1,250 bp were respectively amplified from naturally infected pepper in direct and nested PCR. No band was found from healthy plants and negative control. PCR product with primer pair P1/P7 was ligated into pTZ57R/T using InsT/AcloneTM PCR Product Cloning Kit and transformed to Escherichia coli DH5a cells. The recombinant plasmids were sequenced in both directions. Blast search and phylogenetic analysis using neighbour-joining method with MEGA7 software showed that, the phytoplasmas associated with symptomatic pepper plants collected from Razavi Khorasan province share maximum identity (99%) with members of Clover proliferation group, 16SrVI. Phylogenetic analysis using MEGA7 showed that PWB phytoplasma clustered with 16SrVI group phytoplasmas. Computer-simulated analysis with 17 restriction endonucleases using iPhyClassifier software (http://plantpathology.ba.ars.usda.gov/cgi-bin/resource/iphyclassifier.cgi) showed that, PWB phytoplasma was classified to subgroup A in 16SrVI (similarity coefficient 1.00).
Keywords
Keywords: Phylogenetic analyses, RFLP, Phytoplasma, Pepper (Capsicum annuum)