مسیرهای سیگنالیگ NF-kB در Helicoverpa armigera: شناسایی ژن های درگیر و پاسخ آن ها به آلودگی باکتریایی
XML
نویسندگان
1کمال شهر، نبش میعاد 9، ساختمان ملت8، طبقه اول واحد یک
2گروه بیوتکنولوژی، دانشکده کشاورزی، دانشگاه شاهد، تهران،ایران
3تهران، اتوبان چمران، پل نصرف دانشگاه تربیت مدرس
4کیلومتر 17 اتوبان تهران کرج، بلوار پژوهش، دانشکده کشاورزی تربیت مدرس، خوابگاه احمدی روشن، اتاق 202
چکیده
مسیرهای سیگنالیگ NF-kB ( Imd و Toll ) وابسته به سامانه ایمنی حشرات، با شناسایی و بروز پاسخ ایمنی مناسب، نقش مهمی در کنترل آلودگی های میکروبی دارند. مسیرهای Imd و Toll با بیان صدها ژن شامل پپتیدهای ضدمیکروبی و بسیاری پپتیدها و پروتئین های دیگر، قادر به کنترل عوامل میکروبی هستند. در این پژوهش ژن های مرتبط با مسیرهای Imd و Toll در کرم غوزه پنبه Helicoverpa armigera شناسایی و بیان آن ها بررسی گردید. برای شناسایی این ژن ها در ژنوم H. armigera، mRNAهای موجود در پروژه های ترانسکریپتوم و همچنین ESTهای استخراج شده از NCBI مورد بررسی قرار گرفت. با جستجوی BLAST ژن های Imd و Relish (درگیر در مسیر Imd) و ژن های Spatzel و Dif (درگیر در مسیر Toll) در داده های ترانسکریپتوم این حشره مشاهده گردید. برای بررسی بیان این ژن ها در مراحل مختلف رشدی حشره ( تخم، سنین مختلف لاروی، پیش شفیره، شفیره و حشرات بالغ)، کل محتوای RNA از هریک از مراحل رشدی حشره استخراج گردید .کتابخانه cDNA با استفاده از روش RT-PCR و پرایمر oligodt سنتز گردید. میزان رونوشت ژن های مورد نظر با روش RT-qPCR با استفاده از ژن های رفرنس 18s rRNA و Actin انجام گردید. برای بررسی اینکه آیا ژن های مورد نظر نقشی در آلودگی باکتریایی دارند، سلول های باکتری Serratia marcescens به همولنف لاروهای سن پنج کرم غوزه پنبه تزریق گردید. سپس کل محتوای RNA از لاروهای تیمار شده و شاهد استخراج و میزان بیان ژن های مورد نظر در آن ها بررسی گردید. نتایج نشان داد که تمامی ژن های مورد مطالعه در طی رشد و نمو H. armigera بیان می شوند. میزان بیان Imd بیشتر از سایر ژن ها مشاهده گردید. ما مشاهده کردیم که بیان ژنهای Imd، Relish، Dif، Spatzle در لاروهایی که S. marcescens تزریق شد کاهش یافته و در پاسخ به تزریق E. coli افزایش یافته است.نتایج نشان داد که بیان تمامی ژن ها در لاروهایی که باکتری به آن ها تزریق شده بود کاهش یافت، درحالیکه بیان آن ژن ها در لاروهای شاهد تغییری را نشان نداد. این نتایج نشان می دهد که S. marcescens قادر به سرکوب مسیرهای Imd و Toll است و با این روش سیستم ایمنی ذاتی H. armigera را مهار می کند.
کلیدواژه ها
موضوعات
 
Title
The NF-kB signaling pathways in Helicoverpa armigera: identification of the involved genes and their response to bacterial infection
Authors
Akram Rajablou, jaber karimi, Mohammad Mehrabadi, hamed rahimpour
Abstract
The NF-kB signaling pathways including Imd and Toll pathways play a major role in insect host defense through recognition of microbial infections and triggering appropriate immune responses. During infection, the Toll and Imd pathways control the expression of hundreds of genes including antimicrobial peptides and many other peptides and proteins. In this study, we identified and experimentally confirmed expression of the important genes involved in Imd and Toll pathways of the cotton bollworm, Helicoverpa armigera. To identify these genes in H. armigera genome, we considered mRNAs from whole transcriptome sequences and ESTs extracted from NCBI as well. By BLAST search we found Imd and Relish (involved in Imd pathway), and Spatzel and Dif (involved in Toll pathway), in the transcriptome dataset of this insect. To find whether these genes are expressed in different developmental stages of H. armigera (i.e. the eggs, first to sixth instars larvae, pre pupa, pupa and adults), total RNA was extracted from each stage and cDNA library was synthesized by using RT-PCR and oligodt primer. Transcript levels of the genes were analyzed by RT-qPCR utilizing 18s rRNA and Actin as the reference genes. To see if these genes have any role in bacterial infection, we challenged the fifth instar larvae of the cotton bollworm by injecting Serratia marcescens or Escherichia coli cells into the hemolymph while the control larvae were injected with ds water instead. Total RNA was extracted from the treated and the control larvae at different times post injection and the transcript levels of the target genes were analyzed. The results showed that all the assessed genes were expressed during development of H. armigera. Expression level of Imd was higher than that of the other genes. We found that the expression levels of Imd, Relish, Dif, Spatzle genes were diminished in the S. marcescens -injected larvae while there it increased in response to E. coli injection. There was no change in the expression levels of the control larvae. These results show that S. marcescens is able to suppress Imd and Toll pathways thereby inhibit humeral immune response of H. armigera. The mechanisms that S. marcescens undertaking to suppress these pathways remains to be investigated.
Keywords
Imd, Toll, immune signaling, humeral immune system